骨生物学进展:Osterix的多种功能是出生后小鼠骨骼生长和体内平衡所必需的

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《骨生物学进展:Osterix的多种功能是出生后小鼠骨骼生长和体内平衡所必需的》

Multiple functions of Osterix are required for bonegrowth and homeostasis in postnatal mice

作者:Xin Zhoua, Zhaoping Zhanga, Jian Q. Fengb, Vladmir M. Dusevichc, Krishna Sinhaa, Hua Zhangb, Bryant G. Darnayd, and Benoit de Crombrugghea,1Departments of aGenetics and dExperimental Therapeutics, University of Texas M. D. Anderson Cancer Center, Houston, TX 77030; bDepartment of BiomedicalSciences, Baylor College of Dentistry, Dallas, TX 75246; and cUniversity of Missouri, Kansas City, MO 64108

发表情况:PNAS  2010 Jul 20;107(29):12919-24. doi: 10.1073/pnas.0912855107. Epub 2010 Jul 6.

科学问题

在胚胎发育过程明确对成骨细胞分化和骨形成至关重要的转录因子可以极大地提高我们对骨生物学的认识。然而,对出生后骨形成和体内平衡的转录控制仍然知之甚少。Osx作用于Runx2的下游,是一种含锌指的转录因子,对胚胎成骨细胞分化和骨形成至关重要。尽管Osx在发育过程中在成骨细胞分化和骨形成中起关键作用,但Osx在出生后骨生长和体内平衡中的重要作用尚未得到证实。

重要发现

1. Osx是出生后骨稳态的重要和核心因素,因为它不仅是新骨形成、骨细胞成熟和功能所必需的,也是软骨吸收所必需的。

中文摘要

转录因子 Osterix (Osx) 是胚胎发育过程中成骨细胞分化和骨形成所必需的,但尚不清楚 Osx 在出生后骨生长和骨稳态中是否具有重要功能。在出生后的几个时间点有条件地删除 Osx 表明 Osx 对成骨细胞分化和生长和成年骨骼中的新骨形成至关重要。此外,骨骼中 Osx 的失活严重破坏了骨细胞的成熟、形态和功能。这些发现表明 Osx 在骨细胞的细胞特异性遗传程序中具有重要作用。有趣的是,Osx 失活还导致未吸收的钙化软骨在软骨内骨生长板下方的大面积内大量积聚。该特定区域的特征还在于出乎意料地几乎完全缺乏骨髓细胞,并且破骨细胞的密度和大小显着降低。这种破骨细胞密度的降低可能导致矿化软骨的吸收不足。此外,我们推测异常积累的、主要是裸露的软骨代表了对破骨细胞不利的基质。我们的研究将 Osx 确定为出生后骨骼生长和体内平衡中必不可少的多功能参与者。

英文摘要

The transcription factor Osterix (Osx) is required for osteoblast differentiation and bone formation during embryonic development, but it is not known whether Osx has an essential function in postnatal bone growth and in bone homeostasis. Conditional deletion of Osx at several time points postnatally revealed that Osx was essential for osteoblast differentiation and new bone formation in growing and adult bones. Additionally, inactivation of Osx in bones severely disrupted the maturation, morphology, and function of osteocytes. These findings identify Osx as having an essential role in the cell-specific genetic program of osteocytes. Interestingly, Osx inactivation also led to the massive accumulation of unresorbed calcified cartilage in a large area below the growth plate of endochondral bones. This specific area was also marked by an unanticipated almost complete lack of bone marrow cells and a marked decrease in the density and size of osteoclasts.This diminished density of osteoclasts could contribute to the lack of resorption of mineralized cartilage. In addition, we speculate that the abnormally accumulated, mainly naked cartilage represents an unfavorable substrate for osteoclasts. Our study identifies Osx as an essential multifunctional player in postnatal bone growth and homeostasis.

结  果

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Figure 1.Osxpostnatal 突变小鼠的 Osx 表达模式和骨骼表型。

(A) 对 1 个月龄 OsxΔEX2/+小鼠的冷冻肱骨切片进行抗 eGFP IHC 分析。(B) 抗 eGFP IHC 分析表明,在 2 个月龄 Osxpostnatal突变体的肱骨中表达 Osx 的细胞中,Osx 被有效删除。hp,肥大软骨细胞;ob,成骨细胞;ocy,骨细胞。(C) 2个月大小鼠股骨的 μCT 图像。矿化组织的大量积累(绿色虚线圆圈)和小梁的完全缺失(绿色箭头)。有关他莫昔芬注射的时间表,请参阅材料和方法。Wt/Tam,他莫昔芬处理的野生型小鼠;Wt/Veh,赋形剂处理的野生型小鼠;Null/Tam,他莫昔芬处理的 Osxpostnatal突变小鼠。

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Figure 2. Osx 是出生后生长期间和之后成骨细胞分化和骨形成所必需的。

(A) 钙黄绿素掺入。两次钙黄绿素注射中的第二次在第一次注射后 5 天和处死前 2 天进行。 (B) 戈德纳染色。 (C) Col1a1 在 6 周龄他莫昔芬处理的对照和 Osxpostnatal 突变体的股骨切片上的原位杂交。在 A 和 B 中,塑料切片由 6 周龄他莫昔芬处理的对照和 Osxpostnatal 突变体制备。(D) 成骨细胞标志物的定量PCR分析。从 P24 他莫昔芬处理的小鼠的肱骨中分离出 RNA。(E) 体外成骨分析。( a )从 P24 他莫昔芬处理的 Osxpostnatal 突变体和对照小鼠的颅骨中分离出原代成骨细胞。 ( b )从 2 个月龄的他莫昔芬处理的 Osxpostnatal 突变体和注射载体的对照中分离出 BMSC。细胞在成骨培养基中培养14天。ARS,茜素红染色。

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Figure 3. Osx 是骨细胞成熟和功能所必需的。

(A) 6 周龄小鼠肱骨皮质的SEM图像。(B) 背散射 SEM 图像。箭头,骨细胞;箭头,矿物球形球霰石。(C) 骨细胞标记物的定量 PCR 分析。从他莫昔芬处理的 P24 小鼠的肱骨中提取 RNA。(D) Sost 是 Osx 的直接目标。(上)使用野生型、m1和m2 Sost寡核苷酸的EMSA。重组 Osx 是在杆状病毒中制备的 (23)。对于寡核苷酸序列,参见图 S3C。(下)ChIP 检测。染色质样品由 BMP-2 处理的 MC3T3-E1 细胞制备。在加入 BMP-2 后 0、15、30 和 48 小时收获细胞。在减去对照 IgG 值后,数据表示为输入的百分比。

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Figure 4.Osx 的失活导致生长板下方钙化软骨的大量积累。

(A) von Kossa。(B) 番红 O (SafO) 染色。他莫昔芬处理的 2 个月龄小鼠股骨的塑料切片用于染色。(C) Col2a1 RNA 的原位杂交。从他莫昔芬处理的 6 周龄小鼠的肱骨制备脱钙冰冻切片。gp,成长板。

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Figure 5.异位矿化软骨区域缺乏骨髓细胞和破骨细胞密度降低。

(A) H&E 染色显示,在 6 周龄 Osxpostnatal突变体的股骨矿化软骨区(由支架标记)中,几乎没有骨髓细胞(红色星号)。矿化软骨之间的空间被毛细血管(绿色星号)填充。在突变体的矿化软骨区下方发现了骨髓细胞。(B)他莫昔芬处理的2个月对照和 Osxpostnatal 突变体的股骨干骺端(不包括皮质)中破骨细胞 (Oc) 的组织形态学分析。BS代表矿化组织表面。Tb-1:从生长板到远端 500μm 测量的面积;tb-2:从tb-1末端测量到远端500μm的面积;tb-3:从tb-2末端到远端700μm测量的面积。n = 3/基因型组。* P < 0.05.** P < 0.001.(C) TRAP 染色显示在Osxpostnatal 突变体中发现的破骨细胞的大小远小于他莫昔芬处理的对照小鼠中的破骨细胞大小。箭头表示破骨细胞。

总  结

我们的研究结果表明,出生后,Osx 在成骨细胞分化和骨形成中具有重要作用。Osx也是遗传程序的成熟和充分表达以及出生后骨细胞功能所必需的。此外,我们的数据强烈表明软骨吸收与 Osx 依赖性软骨内骨形成有关。在Osxpostnatal突变体中生长板下积累的未吸收矿化软骨缺乏吸收的部分原因可能是该区域破骨细胞功能和密度的降低以及破骨细胞在软骨支架的表面缺乏骨沉积的情况下吸收软骨的效率低下。 因此,我们的研究将 Osx 确定为出生后骨骼生长和体内平衡中不可或缺的多功能参与者。

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